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Una imagen más brillante y nítida

Los nuevos microscopios iluminan su objeto con haces láser. Conocidos como microscopios confocales, enfocan la luz de láser en un diminuto punto de la muestra, por ejemplo células de animales o plantas, donde una luz fluorescente devuelve el reflejo al detector.
En lugar de guardar la imagen en un paso, estos microscopios escanean el objeto punto por punto, pero tan rápidamente que la imagen aparece en el monitor en menos de un segundo. Las versiones modernas operan con diversos láseres y hasta ocho longitudes de onda de luz que activan diferentes colorantes en la muestra casi simultáneamente. Por lo tanto, los objetos “vivos” se pueden observan en su estado natural.

Tan caliente como un horno
Sin embargo, las muestras pueden resistir la irradiación de láser solamente cuando la intensidad de luz no es demasiado elevada. La densidad de potencia en el foco de un microscopio confocal, que sólo mide 250 nm, puede alcanzar niveles equivalentes a los de un horno.
A finales de la década de los ’80, los fabricantes de microscopios decidieron controlar los haces de láser individual y su intensidad con filtros sintonizables acústico-ópticos (AOTF) que, operando a elevada velocidad, pueden variar la intensidad de haz del 0 al 100 por ciento en un microsegundo. Por consiguiente, es posible usar la luz de un láser diferente para cada punto de imagen con cualquier intensidad deseada.
El secreto de los AOTF es que acoplan las ondas acústicas y ópticas. Un pequeño piezo-cristal genera una onda ultrasónica que se acopla en un cristal óptico de dióxido de telurio, niobato de litio o cuarzo. Esto provoca una red de difracción en el cristal que desvía la luz de una longitud de onda determinada. Si la frecuencia acústica se cambia, la longitud de onda de luz desviada también varía.
 
Por lo tanto, la luz láser de varios colores la zona infrarroja a UV se pueden clasificar y guiar en una fibra óptica que porta la cantidad deseada para cada muestra. La intensidad de la luz también se puede controlar fácilmente, a través del cambio de la intensidad de las ondas acústicas.
“Los AOTF son usados por prácticamente todos los fabricantes de microscopios para seleccionar, regular y cambiar la luz láser”, destaca Volker Seyfried, Director Tecnológico de Leica Microsystems en Mannheim (Alemania).

Figura 1: Modo de operación de un AOTF
Un piezo-elemento acopla una onda acústica en el cristal óptico. Los rayos de luz inciden desde la izquierda y se desvían de forma diferente, dependiendo de la frecuencia acústica.

 Una imagen más brillante y nítida

Sin embargo, el líder del mercado de microscopios confocales es el único fabricante que ha dado un paso adelante: en lugar de emplear AOTF para seleccionar y regular la luz entrante, hace cuatro años que Leica está usando los cristales para recubrir la luz proveniente de la muestra. La técnica fue desarrollada conjuntamente con Crystal Technology, Inc. (CTI), filial de EPCOS con sede en Palo Alto (California – Estados Unidos), logrando una enorme ventaja tecnológica.

Dos AOTF operan de forma inversa
El divisor de haz acústico-óptico (AOBS) se compone de dos AOTF que en ‘modo inverso’ y ofrecen una solución para superar el problema que otros fabricantes de microscopios están tratando de resolver. En microscopia fluorescente, la iluminación azul, por ejemplo, se logra mediante el objetivo de la muestra, reflejado desde los colorantes fluorescentes con una longitud de onda mayor (como el verde) y retorna al detector vía el mismo objetivo. Junto con esto, la luz reflejada se debe separar de la iluminación.
En sistemas convencionales, esto se lleva a cabo con la ayuda de espejos semitransparentes que reflejan las longitudes de onda y, por lo tanto, la luz entrante de láser, en el objetivo se permite el paso de longitudes de onda fluorescentes, por lo que la luz de la muestra puede llegar al detector.
 
La desventaja de este último sistema es que un espejo separado debe girar en el camino del haz para cualquier combinación de líneas de láser y colorantes fluorescentes. Además, es un proceso demasiado lento para biólogos que desean trabajar simultáneamente con varios láseres y colorantes para observar mecanismos de transporte rápido en una célula, por ejemplo, y ralentiza las mediciones y puede provocar errores, como cuando se utiliza un espejo que no comparte la luz proveniente del AOTF.
El AOBS opera de forma muy distinta. Se puede sincronizar con el AOTF de la luz entrante, por lo que el divisor de haz siempre se establece automáticamente con la longitud de onda en uso y el colorante deseado. Todo esto se realiza mediante control informático sin que el usuario tenga que ejecutar ajustes. Además, en comparación con los espejos semitransparentes, el cristal suele ofrecer más del doble de luz procedente de la muestra.
Volker Seyfried añade que “nuestros clientes reconocen la diferencia inmediatamente. Las imágenes son más brillantes y nítidas”.

Figura 2: Comparación entre divisores convencionales y AOBS
Divisor de haz convencional con numerosos espejos semitransparentes AOSB controlable electrónicamente

 Divisor de haz convencional

Tecnología de cristal – el ‘socio’ ideal
Un mayor desarrollo del AOBS no hubiera sido posible sin un partner comprometido y fiable. El socio ideal ha sido Crystal Technology Inc. (CTI), filial de EPCOS especializada en la fabricación de cristales de óxido para aplicaciones ópticas, como láseres, aunque los productos CTI ya se han utilizado en sintonizadores de televisores.
“Decidimos entrar en el prometedor mercado de la microscopia para aplicaciones biológicas”, afirma Jon Fowler, CEO de CTI. “Una decisión valiente con un territorio virgen para nuestra compañía, ya que tuvimos que realizar un enorme trabajo preliminar. Pero en los test, los AOTF convencieron a Leica Microsystems y se confirmó el acuerdo”.
En la actualidad, CTI tiene un cuarenta por ciento de cuota de mercado en AOTF para microscopios, y, en el futuro, la compañía intentará ampliar su clientela en soluciones para gestión de haces de láser. No obstante, los componentes AOBS son exclusivos para Leica.
 

Configuración simple con sintetizador digital
La principal innovación con la que CTI contribuyó en el desarrollo de AOTF fue su driver integrado, que posee un interface que convierte los comandos enviados por el programa de usuario del microscopio en señales RF que dirigen AOTF y AOBS. En el corazón de este interface, que CTI diseñó con la colaboración de partners de los campos RF y software, se encuentran sintetizadores digitales programables (DDS), que se usaron por primera vez para este propósito.

Figura 3: Gestión del AOTF
Diagrama de bloque de la unidad de control del sintetizador digital DDS

 Unidad de control del sintetizador digital DDS

Cada AOTF dispone de su propia memoria con un tipo de sistema de operación para el cristal. Esto facilita que el usuario utilice el instrumento, por ejemplo, fuera del laboratorio. Todos los AOTF también poseen un sensor, que se conecta al módulo DDS para responder a cambios de temperatura con un algoritmo de corrección especial, manteniendo las propiedades ópticas. Crystal Technology tiene múltiples patentes para sistemas de AOTF y DDS.
Después del éxito con los microscopios, Jon Fowler se imagina el desarrollo de AOTF para otros propósitos. Si hay que ofrecer luz de láser con conmutación rápida y sin pérdidas, existe una necesidad. “Ya estamos colaborando con aquellos clientes que desean usar AOTF para clasificar genes o se encuentran dentro del sector de tecnología de seguridad”.

Artículo realizado por el Dpto. Técnico de Anatronic, S.A.

25 June 2007 | Artí­culos | Noticia leída: 1090 veces


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